Антигены и антитела
В основе ИФА лежит реакция «антиген-антитело». Антиген – это любая молекула (обычно белкового происхождения), которую наш организм рассматривает как чужеродную или потенциально опасную. Его появление вызывает иммунный ответ, организм начинает вырабатывать особые вещества — антитела или иммуноглобулины. Они соединяются с антигенами, «помечая» их, или, иначе говоря, образуя иммунные комплексы, которые легче распознаются и уничтожаются клетками иммунитета.
При проведении иммуноферментного анализа основное значение имеет тот факт, что реакция «антиген-антитело» всегда специфична. Для каждого антигена организм вырабатывает особые антитела, которые к тому же различаются между собой в зависимости от сроков появления. Так, первым ответом на проникновение чужеродной молекулы является синтез иммуноглобулинов класса М (IgM). Их содержание наиболее высоко в острый период инфекционного процесса. На следующем этапе иммунная система вырабатывает иммуноглобулины класса G (IgG). Они сражаются с инфекцией до полной победы, а затем продолжают циркулировать в крови, поддерживая иммунитет к повторному заражению. Для лабораторной диагностики значение имеют также иммуноглобулины класса А (IgA), количество которых возрастает при обострении хронического заболевания или скрыто протекающей инфекции. Концентрация и соотношение IgM, IgG и IgA, которые выявляет иммуноферментный анализ, позволяют оценить, на какой стадии находится болезнь.
Реакция антиген-антитело лежит в основе не только иммуноферментного анализа, но и вакцинации. Прививка – это введение в организм ослабленных антигенов микробов и вирусов. Попадая в кровь, они заставляют организм вырабатывать большое количество иммуноглобулинов класса G (IgG), которые при контакте с реальной угрозой быстро подавляют инфекцию — до того, как она нанесет вред здоровью.
Методика проведения теста
Чаще всего ИФА применяют для выявления заболеваний, передающихся половым путем, некоторых вирусов (например, геппатиты и ВИЧ) и TORCH-инфекций. Этот анализ позволяет определить не только сам факт присутствия инфекции, но наличие приобретенного иммунитета к какому-либо заболеванию, например, краснухе или ветряной оспе. Кроме того, ИФА широко применяется для определения гормонального статуса (гормоны щитовидной железы и надпочечников, половые гормоны), а также выявления различных соединений, которые являются причиной интоксикации организма при отравлениях, укусах насекомых или змей. Огромное значение этот метод также имеет для скрининга паразитозов. Для ИФА не имеет значения, где именно и в какой форме находится паразит (цисты, личинки, яйца или взрослая особь).Чтобы организм начал вырабатывать антитела, достаточно самого факта присутствия антигена.
Материалом для иммуноферментного анализа как правило служит сыворотка крови. Реже используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и пр. После забора и очистки исследуемый материал помещают на специальные планшеты с большим количеством лунок, в которых заранее размещены очищенные антигены предполагаемого возбудителя (или — антитела, если задачей является поиск антигенов). Если содержащиеся в материале антитела (антигены) находят пару, образуется иммунный комплекс. При этом особое красящее вещество — хромогенный субстрат вступает в ферментную реакцию с объединенной молекулой, и содержимое лунки меняет цвет. В зависимости от ферментов, которые применяются в качестве маркеров, это изменение регистрируется визуально или при помощи фотометрических, флуорометрических, био- и хемолюминесцентных методов. При этом проведение анализа не занимает много времени. Результаты, как правило, можно получить уже через сутки после забора крови.
У метода существует много разновидностей. Например, при конкурентном ИФА антигены (или антитела) конкурируют с аналогичными меченными антигенами (или антителами) за связывания с антителами (антигенами), находящиеся в лунках.
Иммуноферментный метод позволяет определить не только присутствие возбудителя, но и его количественное содержание. В этом случае более сложная цепь реакций дает возможность оценить концентрацию антител в крови.
Для регистрации ферментативной активности возможно применение фотометрических, флуорометрических, био- и хемолюминесцентных методов, а в ряде случаев (особенно связанных с решением технологических задач) успешно применяются электрохимические и микрокалориметрические.
Метода ИФА постоянно совершенствуется. Так, если для создания так называемых лизатных тест-систем первого поколения, приходилось выделять антитела из биологических сред, что требовало существенных затрат времени, реагентов и других ресурсов, то развитие генно-инженерных методов дало возможность искусственно производить нужные рекомбинантные белки. Сегодня для этого используются клетки насекомых (сверчка, цикады, таракана) или E. coli, что позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена. Именно благодаря высокой степени очистки рекомбинантных белков, которую было просто невозможно достичь при работе с естественными антителами, современные тест-системы имеют практически стопроцентную специфичность и высокую чувствительность.
Интерпретация результатов
В зависимости от оснащения лаборатории иммуноферментный анализ может быть полностью или частично автоматизирован. Большинство современных тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что повышает точность результата. Но ошибки при проведении иммуноферментного анализа все же возможны. Так, хотя в большинстве случаев интенсивность окраски лунок напрямую зависит от количества иммунных комплексов, она не всегда проявляется в полной мере. Такие сомнительные результаты, как правило, подлежат повторному исследованию с обязательным учетом количественных показателей, полученных на спектрофотометре.
При определении антител к различным инфекциям ложноположительные результаты могут возникнуть из-за ревматоидного фактора, иммунодефицита, нарушения обмена веществ или технических ошибок. Кроме того, на результаты ИФА может повлиять прием некоторых лекарств. Чтобы избежать ошибок по крайней мере за неделю до исследования нужно прекратить прием антибиотиков или противовирусных препаратов, а сам анализ лучше проводить натощак.
Интерпретация результатов теста находится в компетенции специалиста лабораторной диагностики и врача, поскольку различные инфекционные заболевания имеют индивидуальное время иммунного ответа. Например, при заражении хламидиями IgM могут обнаружиться уже дней через семь после заражения, IgG подтвердят диагноз хламидиоза, а IgA расскажут о том, что инфекция живет в организме уже более месяца. А вот при цитомегаловирусе антитела класса G станут свидетельством первичной или повторной инфекции, однако не дадут информации, в какой стадии находится этот процесс, тогда как IgMпоявятся в крови как минимум через месяц после заражения и сохраняться от 4 месяцев до полугода.
Важно помнить, что ИФА не выявляет самого возбудителя инфекционного заболевания и его специфичные свойства, а по наличию антител поставить диагноз и уж тем более назначить лечение можно далеко не всегда. Поэтому во многих случаях при положительных результатах теста назначают дополнительные исследования, например, ПЦР или бактериологический посев. Методика ИФА подразумевает, что назначающий исследование врач заранее имеет предположение о природе заболевания. Случайно угадать диагноз с помощью этого теста практически невозможно.
