Ситуация изменилась чуть менее 15 лет назад, когда была разработана новая технология CRISPR/Cas. Она произвела настоящую революцию, поскольку открыла принципиально новые возможности для манипуляций с геномами высших организмов.
Медкарта бактерии
Идея создания технологии CRISPR/Cas родилась при изучении механизмов адаптивного иммунитета, которые бактерии используют для защиты от атакующих их вирусов – бактериофагов. Основу этой системы составляют особые участки генома – короткие палиндромные кластерные повторы, или крисперы (англ. CRISPR – clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Они выполняют роль страниц медицинской карты бактерии, где хранится информация о вирусах, успешно пережитых самой бактериальной клеткой или поколениями ее предшественников.
Каждый раз, когда бактерия сталкивается с новым вирусом, криспер-ассоциированные белки Cas1 и Cas2 (англ. CRISPR associated protein) вырезают кусок чужеродной ДНК и вкладывают его между двумя «страницами», т.е. одинаковыми повторяющимися участками. Эти вырезанные фрагменты, которые называют спейсерами (англ. spacer – «разделитель»), работают как молекулярная память, помогая бактерии и ее потомкам быстро обнаруживать инфекции и предотвращать их развитие. При повторной встрече с вирусом, досье которого уже имеется в медкарте, CRISPR синтезирует его РНК-копию и «вручает» ее специальным белкам, которые ищут и уничтожают всех чужаков, чей геном имеет участок, в точности совпадающий с образцом. Эта система работает настолько точно, что если «записать в медкарту» бактериальную ДНК, она начнет уничтожать саму себя.
Известно два класса CRISPR-систем: у первого «киллерами» работают несколько белков, а у второго – все функции выполняет один очень большой белок. Примером системы второго класса может служить обнаруженная у бактерий Streptococcus pyogenes система CRISPR/Cas типа II-А, которая в качестве «киллера» использует белок Cas9. Задача этого фермента сводится к тому, чтобы получить нужную информацию из «медицинской карты», найти по ней вирус, разрезать его ДНК и запустить цепь реакций, которые приводят к гибели этого бактериофага.
Ножницы и заплатки
Чтобы применить механизм адаптивного иммунитета бактерий для редактирования любого генома, ученые создали упрощенный вариант системы CRISPR/Cas типа II-А, представляющий собой комплекс из белка Cas9 и единой направляющей РНК, которая, в свою очередь, состоит из трансактивирующей CRISPR РНК и короткой «зрелой» кодирующей РНК.
Работает эта система так. Направляющая последовательность опознает целевой участок ДНК и связывается с ним, образуя комплекс криспер. «Ножницы» Сas9 отрезают фрагмент ДНК в нужном месте. А дальше все зависит от того, какую именно модификацию генома намерены произвести ученые. Например, они могут просто удалить определенный фрагмент нуклеотидной последовательности, доверив ее восстановление самому организму. Поскольку разрывы в ДНК могут быть вызваны не только вмешательством генетиков, но и естественными причинами, например химическими агентами или радиоактивным излучением, клетки организма имеют внутреннюю систему репарации. Специальные белки находят «оборванные концы» ДНК и «сшивают» их. Ремонтные белки также могут внести случайные мутации, найти похожую последовательность в геноме и использовать ее в качестве образца для восстановления места разрыва. А ученые могут воспользоваться этим механизмом, чтобы встроить в геном нужную им «заплатку» и получить не случайные, а вполне предсказуемые мутации.
Что на практике?
Благодаря своей простоте и эффективности система CRISPR/Cas за самое короткое время (она была открыта только в 2005 году) уже нашла применение в самых разных областях. Например, с ее помощью удалось получить новые сорта риса, устойчивые к бактериям рода ксантомонас, которые вызывают гниль этой культуры и наносят огромный ущерб сельскому хозяйству.
Ученые широко используют методику CRISPR/Cas9 в исследовательских целях. С ее помощью они, в частности, могут управлять отдельными генами, включая и выключая их при помощи специальных белков. Модифицируя геном животных и растений, исследователи получают возможность изучать роли отдельных генов. А если подобные изменения вносят в стволовые клетки человека, в распоряжении ученых оказываются модели наследственных заболеваний, которые можно без ограничений использовать для поиска потенциальных лекарств. Еще одним перспективным направлением использования этой технологии является выращивание трансгенных животных или растений, способных синтезировать человеческие белки, которые используются в медицине, например инсулин и альбумин.
Но самые большие надежды система CRISPR/Cas дает в области генотерапии. Дело в том, что если провести вмешательство в геном на стадии раннего эмбриона, все клетки выросшего из них организма могут иметь заданную мутацию. Это открывает широкие возможности для лечения наследственных заболеваний. В различных экспериментах уже удалось вырастить из эмбриональных клеток здоровых лабораторных мышей, у которых были скорректированы дефектные гены, отвечающие за развитие катаракты, тяжелого пигментного ретинита, мышечной дистрофии Дюшенна. Однако с человеческими эмбрионами дело оказалось сложнее.
Первый блин комом
Теоретически метод CRISPR/Cas обеспечивает хирургическую точность встраивания нужных генов, которые заменяют дефектные участки ДНК, что позволяет свести к минимуму случайные мутации, злокачественное перерождение клеток и другие потенциальные проблемы. Однако первый эксперимент с человеческими эмбрионами, проведенный китайскими учеными в 2015 году, в противоречие теории показал очень низкую эффективность и высокий уровень ошибок. Так, из 86 оплодотворенных яйцеклеток, после проведенных с ними генетических манипуляций, выжили только 71. В 28 из 54 клеток, отобранных для анализа, фермент Cas9 внес нужные разрывы в геном, но только в четырех случаях восстановление разрыва завершилось встраиванием ожидаемой последовательности нуклеотидов. При этом ученые обнаружили в геноме клеток множественные разрывы там, где их не должно было быть.
Впрочем, китайский эксперимент вызвал в научном сообществе шквал не столько технических, сколько этических вопросов. Два крупнейших научных журнала Science и Nature даже отказались публиковать их выводы, руководствуясь соображениями морали. И когда год спустя британское Human Fertilisation and Embryology Authority (HFEA) – Управление по эмбриологии и искусственному оплодотворению – выдало разрешение на проведение подобных экспериментов одной из научных лабораторий в Соединенном Королевстве, оно сопроводило свое решение множеством дополнительных условий. Так, регулятор заявил, что технологию CRISPR/Cas9 можно применять только в исследовательских целях, предписал ученым уничтожать полученные с ее помощью генно-модифицированные эмбрионы не позднее чем через 14 дней и отдельно оговорил, что речь об их вынашивании идти не может.
Не очень эффективно и очень неэтично
Пока Запад был занят решением этических проблем, китайские ученые, не обремененные подобными ограничениями, сделали следующий шаг. В конце ноября прошлого года исследователь Цзянькуй Хэ объявил о рождении двух девочек-близняшек с геномом, отредактированным при помощи CRISPR/Cas9.
В начале своей работы он исходил из того, люди, имеющие определенную природную мутацию гена CCR5, устойчивы к ВИЧ. Ученые полагают, что эта мутация возникла у европейцев около 700 лет во время пандемии чумы, однако, когда заболевание отступило, она начала «вымываться» из генома. Именно этот ген выбрал Цзянькуй Хэ, чтобы защитить от этого вируса детей, которые имели повышенный риск инфицирования (их отец – носитель ВИЧ). Он внес разрыв в ДНК ранних эмбрионов, запустив механизм случайного, непредсказуемого соединения «оборванных» концов цепочки. В результате одна из появившихся на свет девочек действительно будет защищена от ВИЧ, но ее дети эту защиту, скорее всего, утратят. А вот ее близняшка сохранит чувствительность к вирусу, и ее потомки также не получат защиты.
Таким образом, эксперимент Цзянькуй Хэ получился не слишком впечатляющим, к тому же ученый не смог предсказать его потенциально опасных последствий. Дело в том, что белок под названием C-C рецептор хемокина 5, за копирование которого отвечает ген CCR5, не только связывается с ВИЧ, но и участвует во многих других биологических процессах. Ученым известно не менее 20 его функций, среди которых передача межклеточных и внутриклеточных сигналов, направленное движение клеток, управление воспалительными процессами и пр. Сбой любой из них может повлечь самые серьезные последствия. Например, по последним данным нарушение контроля над воспалительными процессами в мозге, который осуществляет белок CCR5, приводит к развитию рассеянного склероза.
Если мутация гена происходит естественным образом, ее последствия, как правило, компенсируются другими изменениями в геноме, однако произойдет ли это при грубом вмешательстве генетиков, на текущем уровне развития науки предсказать невозможно. Генетики не могут дать никаких гарантий относительно здоровья китайских близняшек в будущем и не исключают, что Цзянькуй Хэ оказал им медвежью услугу, спровоцировав множество других заболеваний.
Использованы фото Shutterstock/FOTODOM UKRAINE
